干貨 | qPCR 實驗中關于 CT 值問題的詳細攻略（上）

qPCR 實驗在分析 C_T 時常常遇到這幾類問題，比如：

• 復孔間重復性差，是否都和操作有關？

• 無模板陰性對照出現 C_T 值時，目的基因的 C_T 值是否還能用？

• C_T 值很大該怎么辦？

今天就給大家分享下，在 qPCR 實驗中遇到關于 C_T 值的常見問題時該如何解決。

復孔間重復性差一般會有以下兩種情況：

（1）C_T 值很大，如 C_T ≥ 30，重復性差屬于正?，F象。該現象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情況下，模板與引物的碰撞存在隨機性，直接導致復孔間的 C_T 值差異較大。

解決方法：如果融解曲線沒有雜峰，無模板陰性對照同目的基因的 △C_T 值為 3 or 5 以上，那 C_T 值為準確的，可多設置幾個復孔，選擇重復性好的 C_T 值參與計算。

（2）C_T ＜30，重復性較差。這種情況一般同操作有關。

解決辦法：從以下幾個方面進行問題的排查：① 加樣準確度；② 移液器吸取液體的準確度；③ 定期校準 qPCR 儀。

① 加樣準確度

• 避免小體積加樣，減少加樣誤差?？梢詫⒁?、SYBR Green Mix、ddH₂O 配置成混合體系，并且增加模板的稀釋梯度，大體積加樣。如：原液 cDNA 添加 1 μL，可以更改為原液 cDNA 稀釋 5 倍，添加 5 μL，使用 ddH₂O 補齊體系至 20 μL 即可。

• SYBR Green Mix、配置的混合體系需要混合均勻。從 -20 ℃ 冰箱拿出的試劑需要完全融化并上下顛倒徹底混勻；配置體系時，將混在一起的 Mix 用移液器吹打混勻。

② 移液器吸取液體的準確度

• 移液器量程定期校準，校準周期為 1 年。

• 購買與移液器配套的槍頭，若槍頭與移液器不匹配，在吸取液體時易出現漏氣的現象，導致吸取量程不準確。

• 在吸取相同量程的液體體積時，注意觀察每次吸取液體在槍頭內的液面高度是否一致。

③ 定期校準 qPCR 儀

• 一般 qPCR 儀校準周期為一年。

  
  

未完待續...

轉自：諾唯贊