干貨 | qPCR 實驗中關于 CT 值問題的詳細攻略（下）

造成 C_T 值偏大的因素較多，主要分為以下兩大類情況：

（1）相同體系，前期實驗 C_T 值正常，本次實驗，所有基因擴增 C_T 值皆偏大。

這種情況下，需要排查 RNA 是否存在降解。如何判定 RNA 是否存在降解呢？可通過 1% 的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

完整度好的 RNA 是有三條帶的，以真核生物為例，三條帶分別是 28s、18s、5s，且 28s 條帶的亮度是 18s 的兩倍，5s 最暗（下圖左）。

如果 RNA 發生降解，會出現三條帶的亮度發生變化，甚至不存在完整的三條帶。如果 28s 幾乎看不到了，整個泳道 Smear 嚴重，說明 RNA 的降解已經很嚴重了，此時 RNA 不建議用作后續的逆轉錄實驗（下圖右）。重新提取 RNA 重復實驗。

（2）該基因第一次擴增，其 C_T 值偏大，而其余基因的 C_T 值正常。

這種情況下就需要判定是因為基因的擴增效率低導致的 C_T 值偏大，還是基因本身的表達量低造成的 C_T 值偏大。

如何判定是因為基因的擴增效率低導致的 C_T 值偏大，還是基因本身的表達量低造成的 C_T 值偏大呢？首先需要計算引物的擴增效率。

可將基因的擴增產物進行梯度稀釋（至少三個梯度，且梯度之間的 △C_T 均一，防止因為操作原因導致標準曲線線性關系差，進而影響擴增效率的計算），同時進行 qPCR。將得到的標準曲線進行引物擴增效率的計算。

關于引物擴增效率的計算，可參考下面的案例：

① qPCR 擴增：

將 qPCR 產物進行原液、1/10、1/100 梯度稀釋，每個梯度設置三個復孔，進行 qPCR 擴增，復孔間 C_T 值取平均值，得到三組 C_T 值。

② 標準曲線繪制及擴增效率計算：

可以在 excel 上進行擴增效率的計算。稀釋梯度可以設置為 -1、-2、-3，每個梯度對應的 CT 值分別為 23.69、27.04、30.27，如下圖，進行標準曲線繪制。

通過標準曲線可以得到線性方程（y = -3.29 x + 20.42）與 R² 值（R² = 0.9999）。將線性方程得到的斜率（-3.29）帶入擴增效率計算公式中：，即可得到擴增效率：101.35%。

只有當擴增效率滿足 90~120%，且標準曲線 R² ≥ 0.99，引物的擴增效率才是合格的，定量出來的 C_T 值才可以用來計算。且擴增效率越接近 100%，引物的擴增性能越優。

1. 若擴增效率不滿足 90~120%，那 C_T 值偏大是因為擴增效率不達標導致的，需要重新設計引物。

2. 若引物的擴增效率滿足 90~120% 前提下，C_T 值仍然很大，則是基因本身表達量低造成的 C_T 值偏大，可以提高模板的添加量，但最根本的方法是改為探針法進行定量。探針法的靈敏度是高于染料法的。

轉自：諾唯贊