干貨 | 常見病毒滅活/去除工藝盤點及解讀

干熱處理是在制品凍干后進行的熱處理。該技術處理溫度為60~100℃，持續時間為30min~4d，需要加入穩定劑，防止蛋白過度變性。一般，溫度越高，病毒滅活時間越短。影響干熱法病毒滅活效果的因素有很多，如制品中組分/蛋白質濃度/凍干穩定劑成分和濃度的差異，制品最終容器的大小/分裝量/凍干曲線和封口形式的差異等，因此，實際生產過程需要嚴格操作。

巴氏消毒法是指在60±0.5℃的環境下，將蛋白質溶液進行連續加熱處理（≥10小時），從而破壞病毒蛋白質及核酸分子結構，使其因變性而無法復制，從而失去傳染性。該方法所采用的高溫條件會使制品中蛋白產品過度變性，因此需要加入穩定劑以保護蛋白聚合及功能活性。

S/D（solvent/detergent）法是指利用有機溶劑和非離子表面活性劑的組合分解脂包膜病毒的類脂膜，破壞脂包膜病毒的類脂膜，類脂從病毒表面脫落，使病毒失去粘附和感染細胞的能力來達到滅活病毒的效果。

有機溶劑常用磷酸三丁酯（TNBP）；非離子表面活性劑如Triton X-100或Tween80，有報道也用Triton X-45等。S/D處理可以滅活脂包膜病毒，對非脂包膜病毒無效。

使用S/D滅活，下游必須有工藝能夠把S/D試劑去除，另外S/D試劑對動物細胞有較強毒性，會影響指示病毒滴度測定檢測限，因此該工藝的驗證需要盡可能提高加入指示病毒的初始滴度或提高病毒檢測方法的靈敏度。

低pH孵放法是重組蛋白藥物純化工藝中常用的關鍵步驟，其操作過程簡單、病毒滅活效果好，其利用有脂包膜類病毒的囊膜和病毒衣殼蛋白在低pH條件下會逐漸變性而使病毒顆粒失去感染能力，從而達到病毒滅活效果。

低pH孵放不僅可以滅活有脂包膜類病毒，還可以沉淀HCP、DNA等雜質，對純化工藝中的雜質去除也起到重要作用。本方法對于無脂包膜類病毒則作用微弱，但在工藝中的低pH（如pH4）處理（有時加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。除此之外，病毒滅活效果還可能受pH值、孵放時間和溫度、胃酶含量、蛋白質濃度、溶質含量等因素影響，滅活效果隨著pH升高滅活效果降低，隨著溫度升高滅活效果升高。

柱層析法（也稱色譜）根據蛋白質的理化性質的不同，進行蛋白分離純化，從而有效分離雜蛋白及消除病毒等污染物。柱層析法包括親和層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析等。使用親和層析去除病毒主要依靠病毒在親和填料中和其他非目標蛋白的雜質發酵液成分一起流穿，并且不受填料壽命的影響。

離子交換層析去除病毒的能力主要是以靜電作用為主導作用，以陰離子層析（流穿模式）為例，在緩沖液為中性或弱堿性（如pH8.0）條件下，病毒帶負電荷，可以和填料帶正電荷的季銨陽離子結合，從而結合到層析填料上，而目的蛋白則流穿，最終達到病毒去除的作用。

病毒膜過濾是利用病毒和蛋白大小的不同，使小于平均孔徑的蛋白通過濾膜，將大于平均孔徑的病毒截留在膜內，從而達到去除病毒的效果。

病毒去除膜過濾可以同時滿足病毒去除效果好、目的蛋白質通過性高(回收量、過濾時間)、目的蛋白質不變性的特點，另外不管是脂包膜病毒還是非脂包膜病毒,無論病毒基因組是 RNA還是DNA，基本靠孔徑大小來去除病毒，所以是當前最可靠的病毒去除技術。根據目的蛋白的大小，可以選擇平均孔徑不同的濾膜，其中平均孔徑為20nm左右的產品被稱為細小病毒濾膜。平均孔徑 35~ 50 nm的濾膜被稱為逆轉錄酶病毒濾膜。

根據PDA Technical Report 41，高TMP（跨膜壓差）是病毒過濾的最劣條件之一。近年來的報告表明，過濾過程中的壓力釋放以及之后的再加壓會影響病毒去除效果。

不同的病毒滅活/去除工藝有著不同的優劣勢與應用領域，實際生產中，應根據潛在污染病毒的特性，結合產品特性和生產工藝、病毒清除工藝的作用機制和清除能力的綜合評估，選擇適宜的病毒清除工藝。

武漢珈創生物技術股份有限公司，創建于2011年，是一家集生物技術服務與研發為一體的高新技術企業，專注于為生物藥品/制品的生產企業及研發機構提供各類細胞（含重組細胞、干細胞、免疫細胞等）及原輔料的質量檢測、病毒清除工藝驗證技術服務。

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符合法規：依據中國藥典2020年版、國藥監注、國家食品藥品監督管理局、ICH、USP等相關要求進行技術服務，包括《生物制品病毒安全性控制》、《動物源性醫療器械病毒滅活/去除有效性驗證的原則》、Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or AnimalOrigin. 1999. ICH Q5A（R1）、Design, Evaluation, and Characterization of Viral Clearance Procedure.2016. USP General Chapter: <1050.1>等。