珈創生物 —— 生物技術服務與研發為一體的高新技術企業
優質高效透明
High quality, efficient and transparent
發布時間：2020-07-14 13:27 信息來源： 閱讀次數： 次
根據治療細胞的類型，我們大致可以分為免疫細胞和干細胞，如下圖所示。
2
CAR-T細胞治療是一種以患者自身T細胞為基礎的治療，通過白細胞分離術收集患者的外周血單核細胞（PBMC細胞)，再分離出特定的T細胞亞群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T細胞。分離出的T細胞起始亞群需要持續和充分的激活才能實現體外擴增，這就需要通過T細胞受體信號和CD28、4-1BB或OX40信號等共刺激信號產生主要的特異性信號，從而激活T細胞。再通過電穿孔、慢病毒或逆轉錄病毒載體，將CAR基因導入激活的T細胞中進行基因修飾，從而得到可表達CAR基因的CAR-T細胞（如下圖所示為整個CAR-T生產的流程）。
曾有報道，作為兩家CAR-T原研藥生產廠家，諾華的Kymriah和Kite制藥的Yescarta在早期CAR-T制備的失敗率都比較高，而這些失敗的原因中除了病人因為個體差異而導致失敗外，制備得到的CAR-T細胞質量和數量也是很重要的因素。
3.1 T細胞刺激后體積監控的重要性
由Springer（施普林格科學）公司于2017發行，題為Methods in Molecular Biology - Acute Myeloid Leukemia - Methods and Protocols （分子生物學方法 -急性髓細胞白血病-方法和方案）的參考標準方法流程中，刊登了一篇名為Generating and Expanding Autologous Chimeric Antigen Receptor T Cells from Patients with Acute Myeloid Leukemia，的文章（如左下圖），由幾位著名的T細胞高手(Saad S. Kenderian, Carl H. June, 和 Saar Gill)編寫的急性髓細胞白血病自體Car-T細胞的生成和擴增方法。
在3.1的＂從AML患者擴增T細胞＂過程，由刺激日起計的第3天，每隔1天要進行細胞計數，保持細胞在1x106細胞/mL。第6天磁珠轉移后，也需要進行細胞計數。
除了細胞計數外，還要通過庫爾特計數和粒度分析儀Multisizer來記錄平均細胞體積（MCV），因MCV上升等于T細胞被激活，而在被激活后的第5-7天達到最大。然后隨著T細胞開始休息而下降。當MCV變為300 fL（通常在第9-14天范圍）時表明細胞得到了充分休息，可以進行后續的冷藏或測試（如右下圖）。
通過監測T細胞的體積，比較不同CAR-T細胞及T細胞的平均體積差異，比較培養激活過程中的體積變化，幫助判斷細胞何時到靜息/穩定狀態，另外幫助判斷細胞的激活強度，為研究做出科學判斷或決定下一步操作，如后期的功能檢測或冷凍保存等。
那么為何庫爾特法的Multisizer可以準確地給出T細胞激活后體積的變化值呢？這是因為庫爾特法的原理，以及Multisizer配備了數字脈沖處理器（DPP），庫爾特的原理是通過檢測單個細胞通過小孔時電壓的變化來精確記錄，并且換算得到每個細胞的體積，而配備的數字脈沖處理器，可以使得檢測的分辨率達到nm級別，所以可以對細胞體積的微小變化都能準確的記錄下來。
另外，如果采用傳統的顯微鏡或其他圖像法儀器觀察細胞體積的變化，不僅看到的是二維的圖，并不能真正反映反映細胞整體真實的體積大小。并且細胞體積的微笑變化，體積表征相對細胞直徑的表征更加明顯。譬如，10um的細胞，直徑變大了5%，由于圖像法的分辨率差很難看出差異，但按體積計算，體積的增加能達到15.7%，加上Multisizer的DPP功能，可以實現所關注粒徑范圍最多400個粒徑分析通道（如下圖所示），真正實現高分辨地檢測體積的變化。
3.2 CAR-T細胞的數量和活率監控
2019年在SCI Immunotherapy雜志發表了一篇重磅文章《TREM1/Dap12-based CAR-T cells show potent antitumor activity》中描述，體外培養擴增過程中，除了使用Multisizer來檢測細胞體積外，細胞數量和活率的檢測也一樣重要。
不同處理得到的CAR-T細胞擴增速率也是不同的，我們可以通過擴增時間的比較來檢查細胞生長狀態的好壞，以此幫助分析得到合適的細胞培養條件和細胞處理方法。
另外，對于進入生產化的細胞產品，所有的分析儀器都需要合規，包括來自FDA 21CFR Part11和GMP生產要求，儀器操作要有多級管理權限，操作和報錯都必須存有電子記錄，Vi-CELL BLU對已經考慮到了這些生產質控的要求，所以分析軟件都能符合這些規定。
CAR-T細胞免疫治療的過程
CAR-T細胞免疫療法在近幾年來被越來越多大眾所了解，也有大量的生物制藥公司加入到CAR-T細胞免疫治療的隊伍，國外目前上市原研藥還是諾華的Kymriah和被吉利德收購德Kite制藥德Yescarta。而國內企業也在加緊研發和上市的步伐，其中復興凱特和藥明巨諾分別在今年的2月和6月遞交了上市申請。如下是這幾家公司CAR-T研發生產上市的進展表。其中，作為國內龍頭之一的南京傳奇也在全力地推動產品的商業化，預計下半年會在美國遞交上市申請。
